国际顶刊CELL发布重要研究，打造非肿瘤单细胞研究“天花板”
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阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆症形式。它是一种缓慢进展的神经退行性疾病，从轻度记忆丧失开始，最终导致广泛的执行和认知功能严重受损。
AD的病理特征包括胶质细胞活化以及神经元和突触的丧失等一系列表现，表现为逐渐加重的记忆障碍，失语，失能等。在AD进展过程中并没有疾病动态分子表型检测，所以需要利用单细胞测序技术解析在AD进展的不同阶段的分子特征以探究其治疗手段。
今天小编就给大家带来一篇发表在Cell（IF=64.5）上，利用大规模AD病例样本进行测序分析的研究型文章。让我们一起来看一下这篇文章是如何利用单细胞测序技术解析大规模AD患者队列疾病进展的分子机制的。
研究背景
单细胞测序技术系统地研究不同细胞类型所受影响程度，从而揭示疾病的病因。然而，AD的研究通常仅在10-21个病患的小样本组中进行，因此未能细致描述一般老年人群中的特征。
目前，尽管阿尔茨海默症的病理研究已经发展到较高水平，但有关晚年认知下降与保持认知功能的潜在分子机制仍未可知。
因此，AD的普遍性病理特征研究突破，可能为疾病治疗手段的发展提供新的机会。
研究内容
01、老年患者前额叶皮层转录图谱
首先作者使用snRNA-seq技术分析了不同阶段的AD患者，并对其中的细胞类型进行分群等常规分析。
图1. 临床患者前额叶皮层组织的RNA-seq测序
作者将重点分析与AD病理学相关的指标。几乎所有细胞类型中都发现了与AD病理学显著相关的差异表达基因，这些DEGs在许多神经元亚型、星形胶质细胞和少突胶质细胞中存在显著重叠。
作者与先前的scRNA-seq研究进行比较，发现多个细胞类型中基因表达变化与阿尔茨海默病相关。额叶前部背外侧皮质（DLPFC）的数据集也发现与全部AD病理学相关的DEGs在两个数据集中存在显著的高度重叠。这种一致性证明了作者结果的稳定性和普适性。
结论：通过单细胞转录组测序发现AD患者不同细胞之间的分子变化。
图2. 在兴奋性神经元亚型中有相同的基因表达变化
02、不同进展神经元亚型病理变化
作者富集了参与神经元投射形态发生、mRNA代谢、染色质组织和突触信号传导的基因。许多与AD病理学正相关的突触基因在NFT阳性神经元中上调。然而，蛋白质组学分析显示，多个兴奋性神经元亚型中与AD相关的基因被下调，包括参与tRNA和脂质代谢的条目。
RT-qPCR确认了在AD病理诊断个体中显著下调的基因。脂质代谢和胆固醇生物合成基因的失调在星形胶质细胞中也明显。脂质代谢的改变伴随着线粒体电子传递链组分基因广泛变化。
结论：AD中存在多个代谢和线粒体异常，可能导致细胞功能障碍。
图3. 与AD病理相关的基因表达变化
03、AD中Cohesin复合物增加
为评估AD对蛋白质复合物的影响，作者计算了人类蛋白质复合物与全局AD病理学的关联，发现Cohesin复合物在严重AD患者的前额叶皮质兴奋性神经元亚型中显著上调。
作者发现与Cohesin复合物呈正相关的基因包括染色质调节因子和DNA损伤应答因子，并且在其他脑区的兴奋性神经元中也存在这种相关性。
结论：AD中Cohesin复合物表达的增加伴随着染色质调节因子和DNA损伤应答因子的表达上调，这可能构成AD发病机制中的重要病理事件。
图4. AD中Cohesin复合物表达伴随着DNA损伤反应升高
04、多阶段AD的基因表达随时间的变化
为了深入分析AD进展的分子变化，作者观察到早期和晚期疾病进展阶段的兴奋性神经元亚型之间存在显著的DEGs重叠。与AD病理学负相关的早期变化在星形胶质细胞、兴奋性和抑制性神经元中富集了参与自噬的基因。与AD病理学正相关的晚期变化在神经元中富集了参与mRNA代谢、染色质组织、DNA损伤应答等的基因。
Cohesin复合物的表达在AD进展过程中有增加的趋势，并在全局AD病理学水平最高的个体中显著升高。
结论：阿尔茨海默病中的基因表达变化在不同脑区之间共享，并且可能以不同的时间模式在大脑的不同区域发生类似的分子变化。
图5. 阿尔茨海默症进展多个阶段基因表达随时间的变化
05、老年人认知障碍的相关分子
为了研究老年人脑中认知障碍的分子相关性，作者分析了与认知功能相关的单个细胞类型的差异基因表达。
与不同认知变量相关的基因在多个兴奋性神经元细胞类型、一部分抑制性神经元亚型、星形胶质细胞和寡突胶质细胞中有显著重叠。
与认知功能正相关的基因富集在脂质代谢通路，而与全局认知功能负相关的基因参与突触信号传导和神经元投射发育。通过RNA原位杂交和免疫组织化学的检测，作者确认了认知障碍个体中NPTX2表达的显著降低。
结论：作者确定了与高度认知功能和老年人脑中的痴呆症相关的常见基因、通路和细胞组分，以及特定于细胞类型的基因。
图6. 老年人脑认知障碍的分子相关性
06、认知弹性与AD病理学的分子相关性
为了研究认知弹性（CR，Cognitive resilience）的潜在分子机制，作者比较了高CR个体与易受AD病理影响个体之间的差异。通过分析与CR和认知衰退弹性（CDR，cognitive decline resilience）相关的兴奋性神经元亚型的差异基因，最后发现了5个基因，它们在多种兴奋性神经元细胞类型中相对于CR存在差异。
作者研究了细胞类型组成随着AD病理进展而变化的情况，以确定易受损的细胞类型。仅有少胶质细胞在AD病理最严重的个体中其相对丰度显著增加。
结论：生长抑素抑制性神经元亚类，尤其是其中的三个亚型，特别容易受到AD病理的影响。
07、认知障碍相关细胞类型差异
接下来，作者探究了与认知衰退相关的高分辨率细胞类型组成差异。
在具有较高认知功能的个体中，多个抑制性神经元亚型显著大量增加。在认知功能较低的个体中，LAMP5 RELN组和SST抑制性神经元亚类的相对丰度显著降低。AD个体中SST神经元的相对丰度较低；针对LAMP5 RELN组的抑制性神经元，具有高度认知弹性的个体中显著更高。
随后作者通过RT-qPCR、RNA原位杂交、免疫组织化学实验来验证结果。
结论：与高认知功能相关的两个抑制性神经元在对AD病理具有高度认知弹性的个体的前额叶皮层中更为丰富。
图7. 与AD病理和认知障碍相关的细胞类型组成改变
研究总结
阿尔茨海默病（AD）是全球最常见的痴呆症状的原因，作者构建了一个老年人前额叶皮层的单细胞转录组图谱，涵盖了来自427名不同程度AD病理和认知障碍的患者的230万个细胞的人脑样本，探究了认知障碍的分子和细胞机制。
研究分析发现了与AD病理相关的蛋白复合物和基因变化，并揭示了与高认知功能、痴呆和对AD病理的抵抗力相关的基因和通路。最后作者通过对晚年保持高认知功能个体中两个不同的抑制性神经元群体提出潜在的AD治疗策略。
这项工作首先最具有挑战性的就是收集了巨大数量的临床样本，颠覆及克服领域中的小样本缺陷，通过大量样本队列更加精准，细致地进行联合分析。
另外一点就是分析的突破点非常新颖，由于覆盖病例较多，首次将病理变化和不同程度的认知障碍进行分子表型化，揭示了不同疾病进展中发挥重要作用的关键因子。
研究拓展
对于其他领域的研究来说，不一定能获取到如此多数量的临床样本，这篇文章更多的是给我们一种分析方法和生物学突破口的提示。
如果想要在临床数据中寻找到关键生物学问题并细致、深刻并且合理地进行挖掘和验证，那这篇文章会在整合大规模临床病例，合理分析的分组以及疾病进展与分子生物学的结合方面给你一个很不错的启发。
原文链接：https://mp.weixin.qq.com/s/iPNkyJ8yL-0X7YPEg4SB4A