细胞凋亡，是细胞遵循内在遗传程序主动、有序走向死亡的过程，作为维持机体稳态、调控发育的核心机制，对其准确检测成为基础生物学与临床病理学研究的基石。在众多检测方法中，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL），凭借其直接靶向凋亡核心特征——DNA断裂，集高灵敏度、高特异性及广泛的样本适应性于一身，成为原位标记凋亡细胞的“金标准”技术，在揭示疾病机理、评估药物疗效等领域发挥着不可替代的作用。

一、技术原理

细胞凋亡进程由一系列紧密调控的生化级联事件驱动。当凋亡终极执行者——半胱天冬酶（Caspases）被激活后，其下游重要靶标核酸内切酶（如CAD/DFF40）也随之活化。这类酶特异性切割染色质DNA，首先产生50-300 kb的大片段，进而以核小体为单位（约180-200 bp）规律性地切断双链DNA，形成众多具游离粘性3’-羟基（-OH）末端的DNA片段。这正是凋亡晚期区别于其他死亡方式（如坏死、焦亡）的典型分子标志。

TUNEL技术利用一种特殊的DNA聚合酶——末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase, TdT）。与依赖于模板的普通DNA聚合酶不同，TdT可以不依赖模板，直接将单个脱氧核苷酸（dNTP）随机地、连续地添加到双链或单链DNA的3’-OH末端。在实验体系中，将荧光素（如FITC、Cy3）、生物素或地高辛标记的脱氧尿苷三磷酸（如FITC-dUTP或BrdUTP）作为底物提供给TdT酶。TdT酶得以高效地将这些标记的核苷酸共价连接到凋亡细胞DNA断裂处暴露的众多3’-OH末端，形成一条带有可检测标签的探针尾巴。

TUNEL示意图

这种标记具有极高的特异性。正常的活细胞或处于增殖周期的细胞，其染色质DNA结构完整，极少暴露3’-OH末端；而坏死细胞虽然DNA也发生随机断裂，但断裂模式与凋亡不同，且数量相对较少。因此，通过检测这些标记信号，即可在单细胞水平上，直接对组织切片或培养细胞中的凋亡细胞进行原位、可视化的定位与定量分析。后续根据标记物类型，可通过荧光显微镜直接观察（荧光法），或者通过酶促显色系统（如辣根过氧化物酶-HRP或碱性磷酸酶-AP结合底物DAB显色）后，在普通光学显微镜下观察（显色法）。

二、操作流程

成功的TUNEL检测始于严谨且优化的实验操作。

其核心流程可概括为样本预处理、通透、标记反应与检测分析四个阶段，其中每一步都深刻影响着结果的可靠性与特异性。

1、样本制备与固定

根据样本类型不同，处理方式各异。石蜡切片需经历标准的二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化；冰冻切片和细胞样本（爬片、涂片）则通常使用4%多聚甲醛（PFA）缓冲液室温固定15-30分钟。固定环节至关重要，它不仅能保存细胞形态，还能终止内源性核酸酶活性，防止DNA被进一步降解，同时固定剂的选择（避免使用乙醇、甲醇等有机溶剂，因其会导致蛋白交联不足）与时间控制（防止过固定导致抗原过度交联而掩蔽）直接影响后续标记效率。

2、通透与内源性酶封闭

为了让TdT酶和标记底物能够顺利进入细胞核接触DNA，必须对细胞膜/核膜进行适度通透。常用方法包括使用0.1%-0.5% Triton X-100或蛋白酶K（20 μg/mL）处理。

蛋白酶K的处理时间（通常10-30分钟）必须通过预实验精确摸索：时间过短通透不足，信号微弱；时间过长则易导致组织或细胞从载玻片上脱落，并可能破坏核酸结构，产生假阳性。对于血细胞丰富（如肝脏、肾）或内源性过氧化物酶活性强的组织，若采用HRP-DAB显色法，必须在通透后进行内源性过氧化物酶封闭（如用含3% H₂O₂的甲醇溶液处理10-15分钟），以降低非特异性背景。

3、TUNEL标记反应

这是实验的核心步骤，需严格按照试剂盒说明书，将TdT酶与标记的dUTP（如FITC-dUTP）按比例混合，配制成反应工作液（现配现用，冰上暂存）。滴加工作液至样本区域，加盖玻片或置于湿盒中，37°C避光孵育（通常60-120分钟）。孵育过程中，酶促反应在DNA断裂末端持续进行。

关键对照的设置必不可少：阴性对照（反应液中不加TdT酶或仅用缓冲液）用于监测非特异性结合背景；阳性对照（用DNase I预处理样本，人为诱导DNA随机断裂）用于验证整个检测体系的有效性。

4、信号检测与复染封片

对于荧光法，反应结束后，用PBS充分洗涤去除未结合试剂，然后进行细胞核复染，最常用的是DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚），它在紫外光激发下发出蓝色荧光，便于对总细胞进行定位计数。最后使用抗荧光淬灭封片剂封片，并在荧光显微镜下，使用对应滤光片（如FITC：激发光490nm，发射光520nm）观察。凋亡细胞核呈现出明亮的特异性荧光（绿色或红色，取决于标记物）。

对于DAB显色法，在TUNEL反应后，需加入链霉亲和素-HRP偶联物，再与DAB底物反应，凋亡细胞核呈现棕黄色或褐色，之后常用苏木素进行衬染，使细胞结构更清晰，便于普通光镜观察。

三、结果分析

获取图像后，严谨的分析和正确的解读是得出科学结论的关键。

在荧光模式下，通常在DAPI（蓝光）显示的细胞核背景中，观察到TUNEL特异性信号（绿光或红光）的共定位。凋亡细胞的核形态常伴有染色质浓缩、边缘化或核碎裂成“凋亡小体”的特征，这有助于与强阳性但形态完整的坏死细胞进行辅助鉴别（尽管TUNEL对坏死细胞也可能呈弱阳性）。

定量分析通常通过计算凋亡指数（Apoptosis Index, AI）来实现，即在同一视野（或多个随机视野）下，统计TUNEL阳性细胞数占总细胞数（DAPI阳性核）的百分比。使用ImageJ、Fiji等专业图像分析软件，可通过设置阈值、分割细胞核，半自动化地进行计数，提高效率和客观性。对于流式细胞术分析的TUNEL样本（如悬浮细胞），则可直接获取荧光强度的定量数据，绘制直方图并进行统计学比较。

分析时需要正视TUNEL技术的固有局限与潜在假象。

假阳性可能源于：样本处理不当（如过度固定、剧烈消化）、坏死细胞DNA断裂、某些增殖活跃的细胞（如肿瘤细胞）也可能存在少量DNA修复性缺口而被标记。

假阴性则可能由于：固定过度导致蛋白交联过紧，掩蔽了DNA末端；某些特殊类型的凋亡（如caspase非依赖性凋亡）可能不出现典型的DNA梯状断裂；或蛋白酶K消化不足，试剂无法有效进入细胞核。

因此，在研究中，常将TUNEL法与Annexin V/PI双染（检测凋亡早期膜变化）、活化的Caspase-3免疫组化等技术联用，进行多参数验证，使结论更加坚实。

四、应用场景案例分析

TUNEL技术凭借其原理上的普适性，在生命科学几乎所有涉及细胞命运研究的领域都大放异彩。

肿瘤研究与治疗领域

TUNEL是评估放化疗、靶向药物、免疫疗法及新型纳米药物诱导肿瘤细胞凋亡效应的关键工具。在系统性纳米颗粒递送PTEN mRNA的研究中，使用TUNEL凋亡检测法来评估体内肿瘤生长抑制的效果。

DOI:10.1038/s41551-018-0284-0

神经退行性疾病与脑科学研究

TUNEL是追踪神经元丢失机制的重要工具。通过TUNEL + NeuN双标实验，证实了海马刀片刺入伤模型能够诱导海马神经元的凋亡死亡，为后续研究该模型下的神经保护疗法（如药物、干细胞治疗）提供了明确的评估指标。

DOI: 10.3390/biology11091365

发育生物学与生殖医学领域

TUNEL技术用于揭示生理性程序性死亡的时空规律。在辅助生殖技术中，TUNE法可用于评估精子DNA碎片率（SDF），这是评价精子质量、预测体外受精成功率的关键指标之一，通过流式细胞术对精子进行TUNEL分析，可以快速、客观地量化DNA受损精子的比例。

DOI: 10.1111/and.13738

毒理学与药物安全性评价

TUNEL是评估药物或环境毒素对特定器官（如肝、肾）细胞毒性的敏感指标。在评估一种新型抗生素的肝毒性时，对给药后小鼠的肝脏组织进行TUNEL与肝细胞标志物的共染色，可以定量分析肝小叶内凋亡肝细胞的数量和分布，从而精确判断药物损伤的部位（如门静脉周围还是中央静脉周围）和程度，这对于药物的安全性优化具有直接指导意义。

左：HeLa对照组；右：Mstn敲除组，可清晰看到右图中大量细胞核呈TUNEL阳性（绿色），显示凋亡显著增加. DOI：10.1016/j.redox.2018.09.009